DETALLES DEL PROYECTO

RESPONSABLE(S):

Prof. Heriberto Correia (04164329814)

TITULO DEL PROYECTO

Estudio de la relación de stm1p con proteínas de choque térmico hsp82 y hsc82 en Sacharomyces Cerevisiae y adaptación a condiciones de estrés

FACULTAD A LA QUE PERTENECE

Ccs.de la Salud

ACTIVIDAD DEL ARTICULO 42 DE LA LOCTI CON LA CUAL SE RELACIONA EL PROYECTO

Ordinal 9, Aparte h

PROBLEMA DEL PROYECTO

Stm1p (STM1; supresor de Tom1) es una proteína de Saccharomyces cerevisiae que fue inicialmente aislada por su capacidad para suprimir la sensibilidad a la temperatura de una mutante tom1. La proteína Stm1 ha sido implicada en diferentes procesos biológicos en los últimos 10 años (desde apoptosis hasta biosíntesis y mantenimiento de los telómeros), fue identificada bioquímicamente como G4p2 una proteína que se une a cuartetos de guanina en extractos completos de células de levadura, el correspondiente gen fue identificado como un supresor multicopia de mutantes temperatura sensible tom1 y htr1 y también supresor multicopia de una mutante delecionada para Pop2. Tom1p es una E3-HECT ubiquitin ligasa, requerida para la progresión del ciclo celular a través de la transición G2/M. Htr1p es una proteína que se une a ARNm con motivos-Puf, requerida para que la célula se recupere de detención en la fase G1 del crecimiento inducido por feromonas. Por otro lado Pop2 es parte del complejo Ccr4p-ARNm deadenilasa involucrado en la expresión de genes durante la derepresión de glucosa. También se ha encontrado que stm1p reconoce específicamente una estructura secundaria de múltiples G*G, ADN triple hélice con motivos-Puf y la sobrexpresión de STM1 en células de levadura causa daño por degradación proteosomal conduciendo a una muerte celular parecida a la apoptosis. Recientemente se encontró que Stm1p interactúa físicamente con Cdc13p, una proteína que se une a ADN de cadena única y que se encuentra en los extremos de los telómeros. STM1 es un supresor multicopia del fenotipo mutante cdc13-1, incluyendo el crecimiento temperatura sensible y el anormal alargamiento de telómeros en cadenas ricas-G. Por otra parte, Stm1p es una proteína asociada físicamente con el ribosoma y facilita la asociación entre la subunidad ribosomal grande y pequeña. Aunque STM1 y Stm1p han sido identificadas por varios investigadores, aún es un hecho aclarar que hace esta proteína actualmente en la célula de levadura y como interviene en diferentes efectos biológicos. Una proteína asociada al ribosoma podría potencialmente intervenir en la iniciación de la síntesis de proteínas modulando la traducción de ARNms claves y de esta manera afectar indirectamente muchos procesos biológicos en la célula, dado el rol central de los ribosomas en la síntesis de todas las proteínas. En este sentido recientemente se encontró que en su asociación con el ribosoma, Stm1p interactúa en un complejo equimolar con ambas subunidades ribosomales y no esta asociado con el ARNm. Funcionalmente la disrupción del gen de STM1 resulta en una hipersensibilidad a la rapamicina y en un defecto en la recuperación celular seguida a la carencia de nitrógeno y reintrodución en un medio rico. Estos efectos coinciden con una severa depleción de polisomas y una reducción total de la síntesis de proteínas. En conclusión, estos datos indican que Stm1p juega un rol crítico en facilitar la traducción bajo condiciones de estrés nutricional y sugiere que Stm1p actúa concertadamente con el blanco de la cascada de señalización de rapamicina (cascada TOR), un principal regulador de múltiples respuestas celulares a los niveles de nutrientes en el medio ambiente, que afecta a varios procesos biológicos incluyendo organización del citoesqueleto de actina, iniciación de la traducción, biogénesis del ribosoma, niveles de permeasa de aminoácidos, autofagia y control transcripcional del metabolismo de nutrientes. Por otra parte están las hsp90, chaperonas moleculares que juegan un papel central en señalización celular ya que son esenciales para el mantenimiento de factores de señalización claves.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

OBJETIVO GENERAL: Estudiar la relación existente entre la proteína stm1p con las proteínas de hsp82 y hsc82 de levaduras. OBJETIVO ESPECÍFICOS 1- Obtener cepas doble mutantes para stm1-hsp82 y stm1-hsc82. 2- Determinar efecto de la doble mutación stm1-hsp82 y stm1-hsc82 en el proceso de síntesis de proteínas de la levadura. 3- Determinar el efecto de la doble mutación en el crecimiento celular de la levadura. 4- Evaluar el efecto de la doble mutación stm1-hsp82 y stm1-hsc82 en el envejecimiento cronológico. 5- Determinar la resistencia de las dobles mutantes a condiciones de estrés como sometimiento a elevadas temperaturas, ph y alta concentración salina. 6- Estudiar el efecto de la doble mutación stm1-hsp82 y stm1-hsc82 en la asociación de subunidades ribosomales. 7- Estudiar el efecto de la doble mutación stm1-hsp82 y stm1-hsc82 en el correcto replegamiento proteico.

ACTIVIDADES DEL PROYECTO

1- Realizar la segunda mutación el las levaduras con mutación simple en hsp82 y hsc82 por el método de sustitución por cassette 2- Obtener los sistemas libre de células de las cepas con simple y doble mutación en diferentes condiciones de crecimiento y evaluación de los mismos en la iniciación y la elongación de la síntesis de proteínas. 3- Realizar curvas de crecimiento con las mutantes sencillas y dobles en medios ricos y restringidos en nutrientes. 4- Realizar curvas para determinar el porcentaje de viabilidad de las levaduras silvestre y mutantes en un cultivo que ha alcanzado su máximo crecimiento (fase estacionaria). 5- Realizar curvas de crecimiento con las levaduras silvestre y mutantes bajo diferentes condiciones de temperatura, pH y concentraciones salinas. 6- Obtener extractos celulares del las levaduras silvestre, y mutantes sencillas y dobles y medición de su capacidad de asociar subunidades ribosomales. 7- Realizar ensayos para determinar el efecto de las dobles mutaciones en el replegamiento adecuado de las proteínas.

PRODUCTOS DEL PROYECTO

Se aportará nueva información de la interrelación existente entre los productos de los genes STM1, HSP82 y HSC82 , y que podrían ser útiles en la comprensión de los procesos en los que intervienen. Estos datos podrían utilizarse en el desarrollo de nuevos fármacos y blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades causadas por hongos. Los resultados obtenidos en este proyecto serán utilizados para la realización de la tesis de la Lic. Yda Méndez, estudiante del doctorado en el IVIC y que realizara su trabajo en el BIOMED bajo la tutela del Dr. Heriberto Correia. La implementación de técnicas de biología molecular levadura servirá de apoyo para la creación de otros proyectos en el BIOMED y contribuirá a la formación de los egresados en la maestría de nuestro instituto.

DEPENDENCIA RESPONSABLE DEL PROYECTO:

OTRA (especifique)

DEPENDENCIA ESPECIFICA

Facultad de ciencias de la salud - Aragua

FECHA INICIO

15/07/2007

FECHA FIN

20/07/2009

MONTO DEL PROYECTO

Bs. 200.000.000,00, Bs.F. 200.000,00
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