DETALLES DEL PROYECTO

RESPONSABLE(S):

Dra. Ana Rita De Lima Rivero (0414-3594226), Dr. Víctor Contreras, Mgsc María C. Navarro

TITULO DEL PROYECTO

Elaboración de un estuche o Kit comercial para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas

FACULTAD A LA QUE PERTENECE

Ccs.de la Salud

ACTIVIDAD DEL ARTICULO 42 DE LA LOCTI CON LA CUAL SE RELACIONA EL PROYECTO

Ordinal 8, Aparte a

PROBLEMA DEL PROYECTO

1. En Venezuela la enfermedad de Chagas es considerada de riesgo para aproximadamente 6 millones de personas que viven en 198 municipios de 14 entidades federales, dentro de un territorio de 101.488 Km2. Históricamente los estados más afectados han sido Trujillo, Lara, Portuguesa y Barinas, debido a sus características geográficas de pie de monte, con zonas cafetaleras y viviendas de bahareque y paja, que facilitan la infestación por Rhodnius prolixus, principal vector intradomiciliario. Los estados con mayores tasas de prevalencia son Carabobo (35,7%), Lara (15,8%), Anzoátegui (9,9%), Portuguesa (9,7%), Táchira (9,5%) y Cojedes (8,9%). En el año 2000 el índice de seroprevalencia fue de 8,3%, predominando en las regiones occidental y central. El índice de seroprevalencia en el año 2000 en los menores de 10 años fue del 1%, mientras que para los años del 96 al 99 se mantuvo por debajo del 1%, lo que significa que la transmisión está aumentando en la población que no había nacido cuando la prevalencia de esta enfermedad era elevada. Los indicadores entomológicos de infestación a Rhodnius prolixus han venido ascendiendo, de un índice casa de 0,7% en 1990 a 5,2% en el año 2000, este último es el más alto de la década. Asimismo los índices parasitológicos presentan un incremento notable en este período, de un índice de infección casa a Trypanosoma cruzi de 0,04 a 0,5%, lo que está acorde con el mayor índice de seroprevalencia en los menores de 10 años. 2. La enfermedad de Chagas cursa con tres fases clínicas que son: una fase aguda donde los daños patológicos son relacionados con la presencia del parásito que puede ser sintomática o no y donde la parasitemia generalmente es elevada, una fase indeterminada donde los pacientes se encuentran aparentemente sanos pero con serología positiva y una fase crónica con mayores manifestaciones cardíacas o digestivas, serología positiva y con pocos parásitos circulantes en sangre. Una parasitemia elevada en individuos con fase aguda hace posible evidenciar directamente o indirectamente su presencia a través de pruebas como examen de sangre al fresco, extendidos de sangre coloreados con coloraciones tipo Romanowski, como el Giemsa, a través de la cual se realiza diagnóstico diferencial con Trypanosoma rangeli y examen de gota gruesa, donde se concentra un mayor número de parásitos en un espacio reducido. Aparte de la demostración del parásito, se puede detectar la respuesta del huésped a la infección mediante pruebas inmunológicas. Éstas están basadas en la capacidad que tiene un individuo de identificar antígenos no propios y reaccionar contra ellos, poniendo en evidencia anticuerpos específicos a antígenos parasitarios. Éstos pueden ser comprobados en las etapas indeterminadas y crónicas de la enfermedad donde la parasitemia es escasa. Las técnicas inmunológicas mas utilizadas son: la reacción de fijación de complemento o Machado-Guerrreiro, la reacción indirecta de anticuerpos fluorescentes, hemaglutinación pasiva o indirecta, la reacción de anticuerpos líticos sanguíneos (ALBA), radioinmunoensayo (RIA) y la prueba de ELISA, que es el método de preferencia en la mayoría de laboratorios clínicos. Adicionalmente hay técnicas de muy alta especificidad y sensibilidad para detectar secuencias nucleotídicas de los ácidos desoxiribonucléicos del núcleo o del kinetoplasto, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual demanda recursos tecnológicos más sofisticados y de alto costo, no accesibles al poblador rural y para efectuar estudios de tipo epidemiológico.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

1. Obtener diferentes estadios (epimastigotas, tripomastigotas, amastigotas) procedentes de parásitos mantenidos bajo diferentes condiciones de mantenimiento en el laboratorio (triatomino-ratón o condición natural y cultivo prolongado en medio de cultivo o condición artificial). 2. Obtener antígenos de diferentes estadios del parásito mantenidos bajo diferentes condiciones de mantenimiento en el laboratorio. 3. Obtener muestras de sueros de pacientes en diferentes fases de la enfermedad de Chagas (aguda, indeterminada, crónica) debidamente caracterizados en forma clínica (sintomatología, ecocardiografía, electrocardiograma). 4. Confirmar la seropositividad de las pacientes chagásicos mediante la elaboración de otras pruebas inmunológicas (reacción de fijación del complemento, hemaglutinación indirecta) o parasitológicas (extendido coloreado, xenodiagnóstico, hemocultivo) según sea el caso. 5. Obtener muestras de pacientes aparentemente sanos clínicamente serológicamente negativos a la enfermedad de Chagas. 6. Obtener muestras de pacientes con patologías que muestren reacción cruzada con enfermedad de Chagas (leishmaniasis cutánea, leishmaniasis visceral, lupus eritematoso sistémico, rangeliosis) clínicamente caracterizados. 7. Evaluar mediante inmunobloting la calidad de los antígenos procedentes de diferentes estadios y condiciones de mantenimiento empleando sueros de pacientes chagásicos. 8. Establecer mediante inmunobloting la capacidad de discriminación de anticuerpos presentes en sueros de pacientes chagásicos, no chagásicos y de otras patologías que suelen dar reacciones cruzadas. 9. Seleccionar en el estadio y condición de mantenimiento que mostraron mayor sensibilidad y especificidad los antígenos de mayor inmunogenicidad y que no mostraron reacción cruzada con otras patologías y proceder a su purificación según técnica a seleccionar en función de las características de las bandas. 10. Estandarización de las condiciones óptimas para el montaje de la técnica de ELISA. 11. Validación de la técnica de ELISA empleando los antígenos seleccionados empleando pacientes en diferentes fases de la enfermedad, sueros de pacientes con otras patologías e individuos controles negativos aparentemente sanos.

ACTIVIDADES DEL PROYECTO

1. Adquisición de materiales y suministros necesarios para el montaje de las diferentes técnicas diagnósticas a ejecutar (electroforesis, inmunobloting, ELISA, Reacción indirecta de Anticuerpos Fluorescentes, Hemaglutinación Pasiva, Hemocultivo, Xenodiagnóstico): acrilamida, membranas de nitrocelulosa, placas de poliestireno para ELISA, conjugados, fluorocromos, etc.) 2. Adquisición de materiales y suministros para el mantenimiento del parásito bajo condición natural (pases alternos chipo/ratón) y condición artificial (mantenimiento prolongado en medio de cultivo): filtros de esterilidad, fiolas, componentes de los medios de cultivo, Frascos para el cultivo de células, suero fetal bovino, antibióticos, frascos de cultivo de vidrio para el cultivo de parásitos, alimento para ratones, etc.) 3. Obtención de diferentes estadios del parásito mantenidos bajo diferentes esquemas de mantenimiento en el laboratorio. 4. Obtención de antígenos de los diferentes estadios mantenidos bajo diferentes esquemas de mantenimiento en el laboratorio. 5. Ejecución de las diferentes técnicas de diagnóstico serológico (Reacción indirecta de anticuerpos fluorescentes, Hemaglutinación, ELISA) y parasitológicos (extendido coloreado, hemocultivo, xenodiagnóstico). 6. Purificación de los antígenos seleccionados en base a sensibilidad y especificidad. 7. Estandarización de las condiciones de trabajo para el desarrollo del estuche o Kit diagnóstico y validación del mismo. 8. Incorporación de varios estudiantes al proyecto de investigación a través de tesis de pregrado y postgrado. 9. Incorporación de varios profesores de la Facultad de Ciencias de la Salud al proyecto de investigación a través del desarrollo de trabajos de ascenso. 10. Informe al Ministerio del Poder Popular para la Salud y Desarrollo tanto Regional como Nacional, sobre los diagnósticos confirmados de la enfermedad de Chagas. 11. Creación de programas de pasantías para estudiantes de pregrado, postgrado y profesionales en el área de competencia de la investigación.

PRODUCTOS DEL PROYECTO

1. Desarrollo de un estuche o Kit diagnóstico para la enfermedad de Chagas con un alto grado de sensibilidad y especificidad mediante la técnica de ELISA. 2. Caracterización de los perfiles peptídico y glicopeptídico de diferentes estadios de Trypanosoma cruzi con utilidad en el área de investigación básica del parásito. 3. Desarrollo de actividades de investigación de estudiantes de pregrado, postgrado y profesores de diferentes Escuelas de la Facultad de Ciencias de la Salud, así como de otras instituciones a nivel local, regional y nacional. 4. Entrenamiento de personal profesional y técnico mediante la oferta de cursos y pasantías en el Laboratorio en las diferentes técnicas a ejecutarse durante el proyecto. 5. Desarrollo de tesis de estudiantes de pre y postgrado pertenecientes a diferentes programas de estudio a nivel local y regional. 6. Publicación de artículos científicos en base a las actividades de investigación desarrolladas en el laboratorio.

DEPENDENCIA RESPONSABLE DEL PROYECTO:

OTRA (especifique)

DEPENDENCIA ESPECIFICA

Facultad de ciencias de la salud - Valencia

FECHA INICIO

12/05/2007

FECHA FIN

12/05/2010

MONTO DEL PROYECTO

Bs. 800.000.000,00, Bs.F. 800.000,00
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