DETALLES DEL PROYECTO

RESPONSABLE(S):

Elizabeth Ferrer

TITULO DEL PROYECTO

Diagnóstico inmunológico y molecular de Teniasis Cisticercosis mediante el uso de antígenos recombinantes y PCR

FACULTAD A LA QUE PERTENECE

Ccs.de la Salud

ACTIVIDAD DEL ARTICULO 42 DE LA LOCTI CON LA CUAL SE RELACIONA EL PROYECTO

Ordinal 8, Aparte a

PROBLEMA DEL PROYECTO

El adulto de Taenia solium y T. saginata producen la teniasis y la larva o cisticerco de Taenia solium produce la cisticercosis humana. La cisticercosis es un problema de salud pública en muchos países de Latinoamérica, África y Asia donde las condiciones sanitarias y socioeconómicas son deficientes. Afecta principalmente el Sistema Nervioso Central, produciendo una serie de alteraciones que puede llevar a la muerte. El diagnóstico de estas enfermedades es difícil de realizar, las técnicas coprológicas y las biopsias tienen baja sensibilidad, las técnicas de imágenes son muy costosas y de difícil acceso a la mayoría de las zonas endémicas. El inmunodiagnóstico es de gran importancia para detectar estas patologías, aunque presenta limitaciones en cuanto a sensibilidad y especificidad cuando se utilizan extractos crudos, dando reacción cruzada con otros parásitos. La difícil obtención del parásito hace necesaria la búsqueda de antígenos específicos independientes del material parasitario. Una alternativa sería la clonación de genes para la obtención de antígenos recombinantes, otra alternativa para el diagnóstico de teniasis sería el uso de PCR. El objetivo del trabajo es la obtención y caracterización de antígenos recombinantes relevantes en diagnóstico de teniasis/cisticercosis y la estandarización de un protocolo de PCR para el diagnóstico diferencial de T. solium/T. saginata. La clonación de los genes se realizará mediante inmunocribado y PCR a partir de genotecas de expresión de cisticercos y adultos de T. solium. Los genes clonados se caracterizarán y los que tengan potencial diagnóstico se subclonarán en vectores para su expresión en bacterias. Se purificarán las proteínas y se evaluará su potencial diagnóstico mediante ELISA e Immunoblot y se estandarizarán las condiciones de reacción de la PCR para el diagnóstico de teniasis, para poder ofrecer técnicas inmunológicas y moleculares que sean sensibles, específicas, y adaptadas a las condiciones de nuestro país. La Teniasis, causada por Taenia solium, puede adquirirse a través del consumo de carne de cerdo poco cocida infectada con cisticercos viables; mientras que la Cisticercosis puede transmitirse a través de aguas y alimentos contaminados con los huevos del parásito, estos se desarrollan a cisticercos en el humano encontrándose generalmente a nivel del Sistema Nervioso Central (SNC) causando la Neurocisticercosis (NCC) que se caracteriza por una serie de alteraciones neurológicas las cuales, dependiendo del número y localización de los cisticercos, pueden llevar a la muerte. La NCC es la enfermedad parasitaria mas importante del SNC y es considerada un problema de salud pública en muchas partes del mundo, especialmente en zonas rurales de Asia, África y América Latina donde las condiciones socioeconómicas y sanitarias son deficientes (Pardini y col., 2001). En vista de lo antes expuesto, en el presente proyecto, se pretende clonar y caracterizar genes codificantes de antígenos de T. solium, para su expresión en bacterias y la evaluación de estos antígenos recombinantes para el diagnóstico de teniasis y cisticercosis, así como también la estandarización de una técnica de PCR para el diagnóstico diferencial de T. solium y T.saginata de manera de proporcionar técnicas de biología molecular sensibles, específicas, reproducibles, adaptadas a las condiciones de nuestro país, que puedan ser usadas para el diagnóstico de estás enfermedades y para estudios epidemiológicos que nos permitan conocer la prevalencia real de estas enfermedades en las diferentes zonas del país y que podrían ayudar a la implementación de programas de control adecuados para el beneficio de las comunidades de bajos recursos, que son las mas expuestas a estas enfermedades y las mas desasistidas.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

Objetivo general: Diseñar técnicas inmunológicas y moleculares para el diagnóstico de teniasis/cisticercosis mediante el uso de antígenos recombinantes y PCR. Objetivos específicos: 1.- Clonar y caracterizar genes codificadores de antígenos de cisticercos y adultos de Taenia solium. 2.- Expresar los genes clonados en sistemas procariotas. 3.- Purificar las proteínas recombinantes por cromatografía de afinidad. 4.- Evaluar las propiedades diagnósticas de los antígenos recombinantes purificados en la detección de teniasis y cisticercosis. 5.- Estandarizar un protocolo de PCR para el diagnóstico diferencial de T. solium y T. saginata.

ACTIVIDADES DEL PROYECTO

Clonación y caracterización de genes codificadores de antígenos de cisticercos y adultos de Taenia solium Para la clonación de los genes en estudio se dispone de genotecas de expresión de cisticercos y adultos de T. solium. La clonación de estos genes se hará mediante inmunocribado de las genotecas de expresión con sueros de pacientes con cisticercosis y teniasis. Además se hará la búsqueda de genes por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la secuencia del Spliced leader (secuencia presente en los antígenos de excreción/secreción) y la secuencia del vector donde están clonados los genes para el diseño de cebadores y de esta manera por PCR amplificar los genes codificadores de antígenos del parásito. Para la clonación de los genes conocidos de interés, se diseñarán cebadores específicos, basados en las secuencias depositadas en los bancos de datos. Los demás procedimientos incluyen Aislamiento y purificación Extracción de ADN plasmídico Secuenciación de ADN La secuenciación se llevará a cabo en el Servicio de Secuenciación del IDEA. Análisis de las secuencias Expresión de antígenos recombinantes en sistemas procariotas Los genes clonados codificantes de proteínas de interés se subclonarán en un vector de expresión apropiado para producir el antígeno recombinante. Se seleccionarán vectores que dispongan de secuencia de clonación múltiple con amplio abanico de lugares de restricción y permitan la fácil expresión y purificación de las proteínas recombinantes en forma soluble. Subclonación en vectores de expresión procariotas Preparación de células competentes Transformación de células competentes con el plásmido Inducción y expresión de la proteína de fusión Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) Purificación de proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad Evaluación de las propiedades diagnósticas .ELISA indirecta con antígenos recombinantes Inmunoblot con antígenos recombinantes Determinación del punto de corte, índices diagnósticos y análisis estadístico Estandarización de la PCR multiple para el diagnóstico diferencial de T. solium y T. saginata

PRODUCTOS DEL PROYECTO

1. obtención de antígenos recombinantes sensibles y especificos para su uso en técnicas de diagnóstico de Teniasis/Cisticercosis, 2. Evaluación de antígenos recombinantes sensibles y especificos para su uso en técnicas de diagnóstico de Teniasis/Cisticercosis 3. Estandarización de un protocolo de PCR para el diagnóstico diferencial de T. solium/T. saginata útil en diagnóstico y estudios epidemiológicos. 4. Incremento del conocimiento del papel de los diferentes genes clonados en la la biología del parásito, por qué y para qué expresa ciertas moléculas 5. Una tesis de posgrado por lo que contribuye al formación del talento humano especializado. 6. Una tesis de Licenciatura por lo que contribuye a la formación de talento humano calificado.

DEPENDENCIA RESPONSABLE DEL PROYECTO:

OTRA (especifique)

DEPENDENCIA ESPECIFICA

Facultad de ciencias de la salud - Aragua

FECHA INICIO

01/04/2007

FECHA FIN

01/04/2010

MONTO DEL PROYECTO

Bs. 120.000.000,00, Bs.F. 120.000,00
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