DETALLES DEL PROYECTO

RESPONSABLE(S):

CédulaNombreCorreo ElectrónicoTeléfonos
V007101850FERRER J ELIZABETHelizabeth.ferrer@gmail.com0412-4938960

TITULO DEL PROYECTO

Estandarización y validación de protocolos de PCR para el diagnostico molecular de la Enfermedad de Chagas.

FACULTAD A LA QUE PERTENECE

Ccs.de la Salud

ACTIVIDAD DEL ARTICULO 42 DE LA LOCTI CON LA CUAL SE RELACIONA EL PROYECTO

Ordinal 8, Aparte a

PROBLEMA DEL PROYECTO

La Enfermedad de Chagas es causada por el Trypanosoma cruzi. Se estima que en el continente Americano existen 18 millones de personas infectadas, especialmente en Centro y Sur América, y se predice que 90 millones están en situación de riesgo de contraer la enfermedad (WHO, 2006). En Venezuela se ha detectado una seroprevalencia de un 11,7 %; una cifra que incluye a un 8,5 % de infantes seropositivos, menores de 10 aňos. Ello es indicativo de una transmisión activa y sugiere que en la actualidad esta patología se encuentra en una condición de enfermedad re-emergente en nuestro país, a pesar de las medidas de control ejecutadas en el pasado y de los planes de vigilancia más recientes propuestos por la Comunidad Andina de Naciones (Añez y col., 1999, 2004). Esta enfermedad comprende una fase aguda corta, caracterizada por una abundante parasitemia seguida de una recuperación completa o de la instauración de la fase crónica de la enfermedad, con una parasitemia escasa y un curso clínico impredecible, que va desde la ausencia de síntomas hasta una enfermedad severa con compromiso cardiovascular y/o gastrointestinal que puede ocasionar la muerte (Prata, 2001). La habilidad del parásito de sobrevivir en la fase aguda y avanzar hasta la fase crónica, así como su distribución anatómica, es asociada a su alta variabilidad genética, ampliamente demostrada por diferentes metodologías (Macedo y col., 1992; Tibayrenc y col., 1993; Souto y col., 1996). El diagnóstico de la Enfermedad de Chagas suele ser difícil de llevar a cabo, la identificación parasitológica, del agente causal pocas veces puede realizarse en las muestras de los pacientes, sobretodo en las fases indeterminada y crónica de la enfermedad donde la parasitemia es escasa. El diagnóstico inmunológico suele ser una buena herramienta pero tiene problemas en cuanto a sensibilidad y principalmente especificidad debido a reacciones cruzadas con otras enfermedades parasitarias relacionadas. Se encuentra reacción cruzada principalmente con Leishmaniasis, con el agravante de que muchas veces estás enfermedades son co-endémicas. También se encuentra reacción cruzada con Rangeliosis que es la infección parasitaria producida por Trypanosoma rangeli, pero que a diferencia de T. cruzi, no produce patología en el humano y puesto que la distribución geográfica de ambos parásitos se encuentra solapada, compartiendo hospedadores vertebrados e invertebrados, se generan dificultades en la interpretación de los datos epidemiológicos de la enfermedad, por emplear pruebas basadas en la utilización de moléculas de superficie comunes que ocasionan los diagnósticos cruzados (Guhl y Vallejo, 2003). El diagnóstico molecular suele ser una buena alternativa debido a su alta sensibilidad y especificidad lo que permite confirmar resultados dudosos, además al detectar material genético parasitario y no una respuesta inmunológica, podría ser utilizado como criterio de cura. La incorporación de las metodologías de PCR representaría además una gran ayuda para el seguimiento de la efectividad de los tratamientos y el levantamiento de la data epidemiológica, siendo todos éstos elementos pertinentes para las medidas de control y prevención de esta enfermedad. En el campo del diagnóstico molecular de la Enfermedad de Chagas, se dispone de información desde finales de los años ochenta, con el desarrollo de protocolos de PCR para la amplificación de fragmentos específicos de ADN del parásito. Las dianas mas utilizadas corresponden a secuencias repetitivas de ADN del parásito, lo que incrementa la sensibilidad de la prueba.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

Objetivo general: Estandarizar y validar protocolos de PCR para el diagnóstico molecular de la Enfermedad de Chagas. Objetivos específicos: 1.- Estandarizar diferentes protocolos de extracción de ADN a partir de parásitos en cultivo y muestras de sangre y suero de pacientes con enfermedad de Chagas y otras enfermedades relacionadas. 2.- Estandarizar las condiciones de reacción de la PCR basada en la detección de ADN satélite de Trypanosoma cruzi. 3.- Estandarizar las condiciones de reacción de la PCR basada en la detección de ADN de mini-círculo de Trypanosoma cruzi. 4.- Estandarizar las condiciones de reacción de la PCR basada en la detección de ADN de la región intergénica del gen del mini-exón (Splice Leader) de Trypanosoma cruzi. 5.- Determinar y comparar la sensibilidad y especificidad de las tres técnicas estandarizadas utilizando ADN extraído de parásitos en cultivo. 6. Validar las técnicas estandarizadas utilizando ADN extraído a partir de muestras de sangre y suero de pacientes con enfermedad de Chagas y otras enfermedades relacionadas.

ACTIVIDADES DEL PROYECTO

Para cumplir con los objetivos propuestos, se requiere desarrollar una sistemática metodología de laboratorio. Para la estandarización de la técnica de PCR se requiere del cultivo de los parásitos in vitro, la estandarización de diferentes protocolos de extracción de ADN a partir de parásitos en cultivo y determinar las condiciones óptimas de reacción de los diferentes reactivos utilizados en los distintos protocolos de PCR, así como también determinar la sensibilidad y especificidad de cada PCR. Posteriormente se validarán los distintos protocolos de PCR estandarizados utilizando muestras de pacientes con enfermedad de Chagas y otras parasitosis relacionadas. Las técnicas a emplear serán las siguientes: .-Cultivo de parásitos. .-Métodos de extracción de ADN a partir de parásitos en cultivo (fenol/cloroformo). .- Métodos de extracción de ADN a partir de parásitos en cultivo (Guanidina-HCl/EDTA Avila y col., 1991). .-Métodos de extracción de ADN a partir de parásitos en cultivo (Chelex100 -Proteinasa K). .-Medida de la concentración y pureza del ADN. .-Electroforesis de ADN en geles de agarosa. .-Estandarización de la PCR para la amplificación del ADN satélite de Trypanosoma cruzi. .-Estandarización de la PCR para la detección de ADN de kinetoplasto de Trypanosoma cruzi. .-Estandarización de la PCR para la detección de ADN de mini-exón de Trypanosoma cruzi. .-Determinación de la sensibilidad y especificidad de la técnica de PCR. .-Análisis de Resultados.

PRODUCTOS DEL PROYECTO

Al finalizar el proyecto se dispondrá de 3 protocolos de PCR basados en la amplificación de dianas moleculares diferentes, debidamente estandarizados y validados para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, disponibles en la región central del país. De manera de tener técnicas moleculares debidamente sensibles y específicas, que permitan tanto el diagnóstico clínico, como estudios epidemiológicos que nos podrían llevar a conocer la prevalencia real de la enfermedad en las diferentes zonas endémicas. De igual manera, los resultados obtenidos permitirán obtener información sobre cuales son los linajes y genotipos del parásito circulantes en la región central del país, información que posteriormente podría relacionarse con las características epidemiológicas y clínicas de la enfermedad a fin de contribuir al desarrollo de programas de control adecuados para ser aplicados en las diferentes comunidades endémicas.

DEPENDENCIA RESPONSABLE DEL PROYECTO:

OTRA (especifique)

DEPENDENCIA ESPECIFICA

Facultad de ciencias de la salud - Aragua

FECHA INICIO

01/04/2007

FECHA FIN

01/04/2010

MONTO DEL PROYECTO

Bs. 150.000.000,00, Bs.F. 150.000,00

FINANCIADO POR

  • INVERSIONES 0220,C.A., por un monto de: Bs. 56.040.997,00, Bs.F. 56.041,00, en el 2005.

TOTAL APORTE:

Bs. 56.040.997,00, Bs.F. 56.041,00

DEFICIT:

Bs. -93.959.003,00, Bs.F. -93.959,00

SUPERAVIT:

Bs. , Bs.F. 0,00
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