DETALLES DEL PROYECTO

RESPONSABLE(S):

Prof. Elizabeth Ferrer

TITULO DEL PROYECTO

Identificación de epítopos de un antígeno de excreciónsecreción de cisticercos de Taenia solium

FACULTAD A LA QUE PERTENECE

Ccs.de la Salud

ACTIVIDAD DEL ARTICULO 42 DE LA LOCTI CON LA CUAL SE RELACIONA EL PROYECTO

Ordinal 8, Aparte a

PROBLEMA DEL PROYECTO

La cisticercosis es una enfermedad parasitaria producida por el cisticerco de Taenia solium, afecta principalmente el sistema nervioso central y es endémica en muchos países de América Latina, África y Asia, en regiones donde las condiciones socioeconómicas y sanitarias son deficientes. En Venezuela se ha detectado la enfermedad en varias zonas endémicas y quizás exista en muchas otras en las cuales no se han realizado estudios, debido a las dificultades en el diagnóstico de la enfermedad, el cual se lleva a cabo principalmente por técnicas de imágenes como, tomografía axial computarizada y resonancia magnética nuclear, pero estás técnicas son muy costosas y de difícil acceso a la mayoría de las zonas endémicas, por lo que el inmunodiagnóstico es muy importante para la detección de la patología, pero presenta limitaciones en cuanto a sensibilidad, especificidad y la disponibilidad del material antigénico. Para solventar estas limitaciones varios investigadores han utilizado antígenos recombinantes con resultados prometedores, sin embargo se han detectado algunas reacciones cruzadas utilizando estos antígenos, por lo que es importante identificar en ellos epítopos específicos para poder utilizar solo estas zonas de las moléculas para el diagnóstico de la enfermedad. Recientemente se clonó un gen correspondientes a un antígeno de excreción secreción de cisticercos de T. solium (B1), el cual tiene potencial diagnóstico, aunque presentó algunas reacciones cruzadas, por lo que la propuesta de investigación comprende la identificación de los epítopos inmunodominantes específicos de este antígeno, utilizando fragmentos de la proteína recombinante y péptidos sintéticos que abarcan la totalidad de la molécula, para de esta manera poder utilizar solo estos epítopos en técnicas de inmunodiagnóstico de cisticercosis mejorando la sensibilidad y especificidad de las técnicas actuales. La Cisticercosis puede transmitirse a través de aguas y alimentos contaminados con los huevos del parásito, estos se desarrollan a cisticercos en el humano encontrándose generalmente a nivel del Sistema Nervioso Central (SNC) causando la Neurocisticercosis (NCC) que se caracteriza por una serie de alteraciones neurológicas las cuales, dependiendo del número y localización de los cisticercos, pueden llevar a la muerte. La NCC es la enfermedad parasitaria mas importante del SNC y es considerada un problema de salud pública en muchas partes del mundo, especialmente en zonas rurales de Asia, África y América Latina donde las condiciones socioeconómicas y sanitarias son deficientes (Pardini y col., 2001). Se estima que 75 millones de personas viven en áreas endémicas de esta enfermedad, con cifras de 400.000 individuos que presentan la enfermedad, 50.000 muertes anuales y un alto grado de discapacidad asociado a las graves alteraciones neurológicas que ocasiona, es considerada también la primera causa de epilepsia de inicio tardío (Bern, 1999; Román y col., 2000). En Venezuela, existe muy poca información sobre la prevalencia y el impacto socioeconómico de estas enfermedades, ya que no son de denuncia obligatoria. El esfuerzo de los grupos de investigación dedicados a esta problemática, ha develado casos de NCC dentro de comunidades indígenas del estado Amazonas (Ferrer y col., 2002), en comunidades rurales de los estados Carabobo y Lara (Ferrer y col., 2003) y en los estados Andinos (Meza y col., 2005).

OBJETIVOS DEL PROYECTO

Objetivo general: Identificar epítopos inmunodominantes específicos de un antígeno de excreción/secreción de cisticercos de Taenia solium. Objetivos específicos: 1-Expresar en el sistema bacteriano (pGEX-4T1/Escherichia coli) el antígeno recombinante completo B1, así como también los truncados correspondientes a las porciones amino-terminal (B1-NT) y carboxi-terminal (B1-CT) del mismo. 2-Purificar por cromatografía de afinidad el antígeno recombinante completo B1, así como también los truncados correspondientes a las porciones amino-terminal (B1-NT) y carboxi-terminal (B1-CT) del mismo. 3-Identificar los epítopos inmunodominantes específicos conformacionales del antígeno B1, mediante las técnicas de ELISA e Inmunoblot utilizando proteínas truncadas (fragmentos amino-terminal y carboxi-terminal de la molécula) y sueros humanos controles 4-Identificar los epítopos inmunodominantes específicos lineales del antígeno B1 mediante las técnicas de ELISA e Inmunoblot y utilizando péptidos sintéticos solapantes derivados de la secuencia aminoacídica deducida del gen B1 y sueros humanos controles. 5-Comparar la reactividad de los epítopos identificados con la del antígeno recombinante completo.

ACTIVIDADES DEL PROYECTO

Para cumplir con el Objetivo Nº 1 se expresarán los genes correspondientes a los antígenos recombinantes B1, B1-NT y B1-CT en el sistema bacteriano (pGEX-4T-1/Escherichia coli). Para ello, se prepararán las células competentes Escherichia coli BL-21 mediante tratamiento con cloruro de calcio y se transformarán con los plásmidos mencionados. Se Inducirá la expresión de las proteínas recombinantes con IPTG 1 mM y se verificará dicha expresión mediante geles de poliacrilamida con Dodecil Sulfato Sódico. Para cumplir con el Objetivo Nº 2 se purificarán por cromatografía de afinidad con Glutation-agarosa los antígenos recombinantes B1, B1-NT y B1-CT, se estandarizarán todas las condiciones para la purificación, de manera de obtener mayor rendimiento y posteriormente se les determinará la concentración proteica a las fracciones purificadas, por la técnica de Bradford. Para cumplir con el Objetivo Nº 3 se estandarizarán las condiciones de reacción, se determinará la concentración óptima de antígeno a utilizar, la dilución óptima de los sueros y la dilución óptima de conjugado para ello se realizará la técnica de ELISA con las diferentes concentraciones y diluciones utilizando sueros controles positivos (n = 20) y sueros controles negativos (n = 20). Además, se aplicará la técnica de ELISA para calcular el punto de corte. Para el Inmunoblot se estandarizaran las condiciones de concentración de antígeno y diluciones de sueros y conjugado, así como tiempos de reacción de manera que se observe el reconocimiento de bandas nítidas. Posteriormente se realizarán las técnicas ELISA e Inmunoblot con los antígenos recombinantes purificados y los sueros controles descritos. Para la técnica de ELISA se sensibilizarán las placas con la concentración del antígeno correspondiente en tampón carbonato-bicarbonato, pH 9,6. Se incubarán a 4 ºC toda la noche. Posteriormente se colocarán los sueros diluidos y se mantendrá durante 1 hora a 37 ºC. Se lavarán las placas 3 veces, 5 min, con PBS_Tween 20 al 0,05%. Luego se añadirá el conjugado diluido (anti-IgG humana acoplado a la enzima peroxidasa) y se incubarán a 37 ºC durante una hora. Seguidamente se añadirá el sustrato ABTS y se incubará nuevamente a 37 ºC durante 20 min. Se leerá la densidad óptica a 405 nm en un lector de ELISA. En cuanto al Inmunoblot se sensibilizaran las membranas de nitrocelulosa con los antígenos recombinantes B1, B1-NT y B1-CT y sobre ellas se hará la reacción con las condiciones estandarizadas, solo que utilizando como sustrato Diaminobencidina-Niquel. De esta manera se identificarán los epítopos conformacionales del antígeno B1. Para cumplir con el Objetivo Nº 4 Se identificarán los epítopos lineales del antígeno B1, utilizando péptidos sintéticos solapantes, derivados de la secuencia deducida del gen (péptidos B1-1, B1-2, B1-3, B1-4, B1-5 y B1-6), utilizando las técnicas de ELISA e Inmunoblot, en las condiciones descritas anteriormente y utilizando los sueros controles mencionados. Para cumplir con el Objetivo Nº 5, se comparará la reactividad obtenida con los sueros controles y los antígenos recombinantes truncados y los péptidos sintéticos, tanto por ELISA como por Inmunoblot, con la obtenida con la molécula B1 completa.

PRODUCTOS DEL PROYECTO

Al finalizar el proyecto se obtendrá 1.- La identificación de los epítopos inmunodominantes especificos del antígeno de excreción/secreción de cisticercos de T. solium 2.- Técnicas de ELISA e inmunoblot, basada en la utilización de los epítopos identificados, sensibles y especificas de manera de poder mejorar las técnicas de diagnóstico de Cisticercosis. 3.- La disponibilidad de estas técnicas, que podrían utilizarse tanto para diagnóstico como para estudios epidemiológicos. 4.- A nivel académico, un mejor conocimiento de las relaciones parásito hospedador y la respuesta inmune del individuo. 5.- El proyecto incorpora una tesis de Licenciatura en Bioanálisis por lo que contribuye a la formación de talento humano.

DEPENDENCIA RESPONSABLE DEL PROYECTO:

OTRA (especifique)

DEPENDENCIA ESPECIFICA

Facultad de ciencias de la salud - Aragua

FECHA INICIO

01/04/2007

FECHA FIN

01/04/2008

MONTO DEL PROYECTO

Bs. 25.000.000,00, Bs.F. 25.000,00
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