DETALLES DEL PROYECTO

RESPONSABLE(S):

CédulaNombreCorreo ElectrónicoTeléfonos
V011525430WILKESMAN G JEFFjwilkesm@uc.edu.ve02418688229

TITULO DEL PROYECTO

ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD SULFO-REDUCTORA DEGRADADORAS DE DIBENZOTIOFENO PRESENTES EN BACTERIAS TERMÓFILAS

FACULTAD A LA QUE PERTENECE

Ciencias y Tecnología

ACTIVIDAD DEL ARTICULO 42 DE LA LOCTI CON LA CUAL SE RELACIONA EL PROYECTO

Ordinal 8, Aparte a

PROBLEMA DEL PROYECTO

Venezuela es uno de los principales países productores de petróleo, siendo ésta la principal fuente de ingresos y de obtención de recursos en la economía del país. En los últimos años se ha generado un gran interés en lo que al mejoramiento del petróleo se refiere, debido a la disminución de nuestras reservas de crudos livianos y medianos, por lo que se observa la necesidad de procesar más, y en mayor cantidad las reservas de crudos pesados. La refinación de este tipo de petróleo requiere de tecnologías más complejas y costosas para su producción, transporte y procesamiento [1]. Los compuestos de azufre en el petróleo son muy variados, puede encontrarse en crudos en estado disuelto, en forma coloidal, en forma elemental, como sulfuro de hidrógeno disuelto (ácido sulfhídrico) o como mercaptanos (tioles), sulfuros (tioesteres) y polisulfuros, sulfuros cíclicos y derivados del tiofeno; su distribución en las fracciones o cadenas carbonadas del petróleo es irregular, comúnmente la mayor parte de estos átomos se concentran en las fracciones pesadas, en particular en el residuo resinoso asfáltico llamado asfalteno, los cuales presentan una estructura molecular extremadamente compleja, conformados por diferentes proporciones de nitrógeno, azufre y oxigeno. Los tiofenos, benzo- y dibenzotiofenos (DBT) representan la forma molecular predominante en las fracciones pesadas de los crudos, haciéndose de particular relevancia en los crudos pesados, entre los cuales se encuentra el DBT [2]. La remoción de azufre de los hidrocarburos representa un reto de impacto ambiental que posicionaría los combustibles fósiles ante el nuevo milenio como opción de manejo de emisiones limpias. Es un hecho demostrado que los cambio climáticos que han ocurrido en la era reciente son debido a la incorporación en la biosfera de sustancias toxicas [2]. Las emisiones de SO2 por combustión de combustibles fósiles, dan lugar a H2SO4, el cual precipita con las lluvias, produciendo la lluvia ácida. También es conocido que algunos compuestos de azufre degradan y reducen la vida útil de los catalizadores de uso convencional en las refinerías, así como las pequeñas cantidades de H2S en los crudos deben tomarse en cuenta debido a su acción agresiva frente a los metales. Un contenido de H2S en el gas natural impone restricciones económicas, por su toxicidad y corrosión, incrementa el costo de su procesamiento y transporte. A parte de esto los derrames en los mares y ríos del crudo que contiene compuestos orgánicos azufrados pueden ocasionar su acumulación en los tejidos de la fauna presente en estos ecosistemas, convirtiéndolos en alimentos no aptos para el consumo humano. Desde hace mucho tiempo las compañías petroleras se han dedicado a hallar la manera de reducir el impacto ambiental y disminuir los costos del tratamiento y producción de crudos pesados, el uso de bacterias o sus productos metabólicos representa una alternativa con gran potencial de aplicación bajo el criterio de tecnologías limpias, que no perturben el ambiente y sean de bajo costo, como la biodesulfuración [2]. Consecuentemente es importante el estudio de Bacterias termófilas sulforreductoras provenientes de Lodo termal de Las Trincheras, que utilizan DBT como fuente única de carbono y azufre [3], para así comprobar su capacidad de degradar dicho hidrocarburo, verificando su trabajo extracelular y fraccionando el sistema enzimático que efectúa tal desulfuración.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

Objetivo general Fraccionar la actividad sulfo-reductora de bacterias termófilas degradadoras de dibenzotiofeno. Objetivos específicos - Crecer cepas bacterianas en presencia de dibenzotiofeno. - Obtener fracciones libres de células que contengan la actividad sulfo-reductora. - Fraccionar los filtrados libres de células por cromatografía de intercambio iónico y exclusión molecular. - Detectar la actividad sulfo-reductora en las fracciones aisladas en los procedimientos cromatográficos. - Desarrollar técnicas zimográficas para la detección de actividad sulfo-reductora en las fracciones aisladas.

ACTIVIDADES DEL PROYECTO

Recolección del material biológico Se aislará de las aguas y lodos del Centro Termal Las Trincheras cepas bacterianas capaces de degradar DBT Crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano se realizará en dos medios distintos: a.- Crecimiento en caldo nutritivo El crecimiento en caldo nutritivo (CN), se realiza con el fin de obtener biomasa. Inóculos de 1 mL serán transferirdos a 100 mL de medio, y se incuba sin agitación a 55 ºC por 72 h. b. Preparación de medios DBT Para estos cultivos se tomarán alícuotas provenientes de los cultivos en CN previamente descritos y se transferirán al medio DBT, con la siguiente composición por cada 250 mL: 3,25 mg de MgCl2, 15 mg de CaCl2¿2H2O, 125 mg de KH2PO4, 250 mg de NaCl y 2 mg de DBT para los experimentos con una concentración de sustrato de 0,36 μM y 55 mg para los ensayos en donde se emplea una concentración final de 10 μM. Determinación de la actividad sulfo-reductora Para la determinación de la sulfo-reducción de forma cualitativa, se tomará una muestra y se agregará 1 mL de FeSO4 0,1 M, se incubará bajo condiciones establecidas, hasta la aparición de un precipitado oscuro, indicativo de la formación del FeS. Determinación de DBT remanente en los cultivos por cromatografía de gases utilizando un detector de azufre Alícuotas de 4 mL a las 0, 24 y 72 horas de incubación se filtran al vacío utilizando una membrana microbiológica de diámetro de poro de 0,45 micras, y el filtrado libre de células (FLC) obtenido, se procesa de acuerdo a los siguientes protocolos: a.- Tratamientos de las muestras para cromatografía de gases: alícuotas de 2 mL del filtrado, son extraídas con 4 mL de tolueno; luego 0,5 μL de los extractos orgánicos, son inyectados en un cromatógrafo de gases, empleando un detector de azufre. b.- Para constatar que el sistema enzimático de sulfo-reducción trabaja extra-celularmente, alícuotas de 1 mL de FLC se mezclan con 10 mL de medio DBT fresco bajo las condiciones previamente establecidas. Se incuba por 72 h y se toman alícuotas para luego tratarlas como en la sección a. Determinación de DBT remanente en los cultivos por cromatografía de gases empleando un detector de ionización a la llama (FID) Alícuotas de 4 mL provenientes de cultivos en medio DBT 10 μM se extraen con tolueno y se analizan por cromatografía de gases, empleando un equipo acoplado a un detector de ionización a la llama (FID). Fraccionamiento y purificación de enzimas a.- Cromatografía de intercambio aniónico Para el fraccionamiento de los FLC, se empleará una columna de intercambio aniónico, utilizando como resina DEAE-celulosa. b.- Análisis de perfiles polipeptídicos de los FLC por electroforesis en geles de poliacrilamida Se realizará electroforesis en geles de poliacrilamida al 10 %. La electroforesis se revelará por el método de tinción con plata. Análisis zimográfico Para visualizar la actividad enzimática correspondiente al efecto sulfo-reductor, la muestra se concentrará y se correrá en geles de poliacrilamida al 10 %, en ausencia de β-mercaptoetanol y calor. Finalmente los geles se colocarán en una solución ferrosa 0,1 M mezclada con DBT 20 μM.

PRODUCTOS DEL PROYECTO

1. Aislamiento de una cepa reductora de DBT 2. Extracción aislamiento y purificación de una actividad enzimática reductora de DBT 3. Estudio de biodegradación de DBT con la cepa aislada. 4. Estudio de factibilidad del uso de la cepa en procesos de biodegradación de sitios contaminados con petróleo.

DEPENDENCIA RESPONSABLE DEL PROYECTO:

Facultad Experimental de Ciencia y Tecnología

DEPENDENCIA ESPECIFICA

ninguna

FECHA INICIO

01/02/2008

FECHA FIN

01/06/2009

MONTO DEL PROYECTO

Bs. 200.000.000,00, Bs.F. 200.000,00
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